Colorazione di Gram

I test microbiologici più comunemente utilizzati per la determinazione della causa di un’infezione batterica sono la colorazione di Gram e l’esame colturale. Spesso, la determinazione della presenza di batteri Gram-positivi o Gram-negativi è di per se sufficiente per la prescrizione di un trattamento antibiotico nell’attesa di esami più specifici e approfonditi, come l’esame colturale. L’assenza o la presenza di leucociti fornisce inoltre delle informazioni utili riguardo l’appropriatezza del campione prelevato e analizzato, dal momento che spesso nelle sedi di infezione sono presenti i leucociti.

La colorazione di Gram può essere anche parte dell’esame colturale. Essa infatti viene eseguita anche sui campioni prelevati dalle colture batteriche cresciute in laboratorio, al fine di fornire una prima classificazione dei batteri presenti e quindi un’indicazione sugli esami di approfondimento da eseguire per l’identificazione precisa della causa dell’infezione.

Anche i funghi, inclusi i lieviti, possono essere rilevati tramite la colorazione di Gram.

La colorazione di Gram viene di solito prescritta insieme all’esame colturale nel caso in cui il clinico sospetti un’infezione fungina o batterica. Inoltre, viene eseguita in seguito ad un risultato positivo all’esame colturale, utilizzando un campione prelevato dalla coltura cresciuta in laboratorio. I risultati del test vengono forniti subito in modo da guidare le scelte terapeutiche.

Un risultato negativo della colorazione di Gram viene riportato come “nessun organismo presente”. Tale risultato può indicare l’assenza di un’infezione batterica o la presenza di un numero insufficiente di batteri nel campione per essere rilevato all’esame microscopico.

Un risultato positivo include invece la descrizione di ciò che è stato visto al microscopio. Il referto in genere riporta:

• Se i batteri visti sono Gram-positivi (viola) o Gram-negativi (rosa)
• La forma – rotonda (cocchi) o a bastoncello (bacilli)
• Le dimensioni, la quantità relativa e/o il raggruppamento
• Se i batteri sono all’interno di altre cellule (intracellulari)
• La presenza di leucociti e globuli rossi
• La presenza di funghi (nella forma di lieviti o muffe). I lieviti possono apparire come singole cellule con eventuali segni di gemmazione, mentre le muffe appaiono come una sorta di ramificazioni simili a quelle di una pianta, chiamate ife. Per identificare il tipo di funghi presenti sono necessari ulteriori test.

Queste informazioni, insieme con i segni e sintomi del paziente ed altre evidenze cliniche, possono indirizzare il clinico verso la scelta del trattamento più efficace da somministrare al paziente nell’attesa del risultato dell’esame colturale. La colorazione di Gram infatti viene considerato un esame preliminare; pertanto per la conferma della diagnosi deve essere effettuato un test colturale, molecolare e/o immunochimico. Talvolta può essere utile effettuare anche un test di sensibilità al fine di determinare la classe di antibiotici maggiormente efficace nel trattamento dell’infezione.

Alcuni esempi di batteri di interesse clinico rilevabili tramite la colorazione di Gram sono:

• Cocchi Gram-positivi – Staphylococcus aureus, responsabile delle infezioni della pelle e della sindrome da shock settico, e Streptococcus pneumonie, responsabile della polmonite.
• Cocchi Gram-negativi – Neisserie meningitidis, che causa la meningite, e Neisserie gonorrhoeae, responsabile della malattia sessualmente trasmissibile chiamata gonorrea.
• Bacilli Gram-positivi – Bacillus anthracis (antrace) responsabile di infezioni della pelle o polmonite (noto anche per essere un agente di bioterrorismo); Listeria monocytogenes che causa una malattia di origine alimentare.
• Bacilli Gram-negativi – Escherichia coli, causa frequente delle infezioni del tratto urinario.

I campioni come il sangue e il liquido cefalorachidiano devono essere sterili. I batteri non sono presenti se non in corso di infezioni batteriche. I batteri potrebbero essere presenti in piccolo numero nelle fasi iniziali di un’infezione, pertanto questo tipo di campioni richiede un processamento volto a concentrare i batteri eventualmente presenti al fine di poterli rilevare anche tramite l’esame microscopico.

Altri fluidi corporei o altre sedi, come l’escreato o la pelle, hanno invece normalmente una flora batterica residente oltre ad altri batteri che potrebbero essere la causa dell’infezione. Pertanto, l’esame microscopico con la colorazione di gram richiede che l’analisi sia operata da un laboratorista esperto in grado di discriminare tra la flora batterica normale e i patogeni presenti.

Le infezioni batteriche non dovrebbero essere sottovalutate nonostante la presenza di sintomi lievi. L’uso di trattamenti mirati e tempestivi può limitare la diffusione e la gravità dell’infezione. Se non trattate, le infezioni batteriche possono diffondersi ed eventualmente causare danneggiamento tissutale e d’organo.

I virus non possono essere rilevati tramite la colorazione di Gram.

Nel caso in cui il clinico sospetti un’infezione da micobatteri, come la tubercolosi, al posto della colorazione di Gram dovrebbe essere richiesto lo striscio e la coltura AFB effettuata sull’escreato.

Il trattamento principale per la maggior parte delle infezioni batteriche consiste nella somministrazione di terapia antibiotica. Nel caso di ascessi, è necessario effettuare incisioni o drenaggi poiché la concentrazione effettiva dell’antibiotico nella sede dell’infezione non sarebbe tale da poter essere efficace senza la preventiva rimozione del pus presente.

La colorazione di Gram non è utile nel caso in cui i batteri patogeni (che causano l’infezione) non siano facilmente differenziabili dalla flora batterica normale. Per esempio, la colorazione di Gram effettuata su un campione proveniente dalla gola non è utile poiché i batteri “buoni” e quelli “cattivi” al microscopio sono indistinguibili.

La colorazione di Gram viene normalmente eseguita insieme all’esame colturale ed eventualmente al test di sensibilità. In questo modo i batteri responsabili dell’infezione possono essere identificati più facilmente e può essere somministrata la terapia antibiotica più appropriata. Per la formulazione della diagnosi sono disponibili altri test, inclusi i test immunochimici, che prevedono il riconoscimento dell’antigene e dell’anticorpo, e i test molecolari, che rilevano il materiale genetico del batterio.

(© 2012) Cavanaugh D, Keen M, American Society for Microbiology. The Gram Stain: An Animated Approach. Available online at http://www.microbelibrary.org/library/gram-stain/3018-the-gram-stain-an-animated-approach through http://www.microbelibrary.org. Accessed September 2013.

(Updated July 22, 2103) Smith A, Hussey M, American Society for Microbiology. Gram Stain Protocols. Available online at http://www.microbelibrary.org/component/resource/gram-stain/2886-gram-stain-protocols through http://www.microbelibrary.org. Accessed September 2013.

(Updated February 21, 2013) Patolia S, et al. Gram Stain. Medscape Reference article. Available online at http://emedicine.medscape.com/article/2093371-overview through http://emedicine.medscape.com. Accessed September 2013.

Uehara Y, et al. Impact of Reporting Gram Stain Results from Blood Culture Bottles on the Selection of Antimicrobial Agents.Am J Clin Pathol 2009 132:18-25. Available online at http://ajcp.ascpjournals.org/content/132/1/18.full?sid=b349478c-9108-4e9c-b957-5547886cb78c through http://ajcp.ascpjournals.org. Accessed September 2013.

Munson E, et al. Mechanisms To Assess Gram Stain Interpretation Proficiency of Technologists at Satellite Laboratories. J. Clin. Microbiol. November 2007 vol. 45 no. 11 3754-3758. Available online at http://jcm.asm.org/content/45/11/3754.long through http://jcm.asm.org. Accessed September 2013.

Forbes, B. et. al. (© 2007). Bailey & Scott's Diagnostic Microbiology, 12th Edition: Mosby Elsevier Press, St. Louis, MO. Pp 80-83.

Physician's Office Laboratory Microscopy Atlas, 3rd ed, 2007. Henderson & Murray. American Academy for Family Physicians Proficiency Testing.

Pagana, K. D. & Pagana, T. J. (© 2007). Mosby's Diagnostic and Laboratory Test Reference 8th Edition: Mosby, Inc., Saint Louis, MO. Pp 694, 707, 714, 883-884.

Wu, A. (© 2006). Tietz Clinical Guide to Laboratory Tests, 4th Edition: Saunders Elsevier, St. Louis, MO. Pp 1564-1565.

Forbes, B. et. al. (© 2007). Bailey & Scott's Diagnostic Microbiology, 12th Edition: Mosby Elsevier Press, St. Louis, MO. Pp 80-83.

Vorvick, L. (Updated 2009 August 9). Endocervical gram stain. MedlinePlus Medical Encyclopedia [On-line information]. Available online at http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003753.htm. Accessed February 2010.

Yuki Uehara, Y. et. al. (2009 September 18). Impact of Reporting Gram Stain Results from Blood Culture Bottles on the Selection of Antimicrobial Agents. Medscape Today from American Journal of Clinical Pathology [On-line information]. Available online at http://www.medscape.com/viewarticle/708594 through http://www.medscape.com. Accessed February 2010.

Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 21st ed. McPherson R, Pincus M, eds. Philadelphia, PA: Saunders Elsevier: 2007, Pp 1016-1017.