Tecniche di Laboratorio

Le immunoglobuline sono proteine prodotte dal sistema immunitario in grado di riconoscere, legare e neutralizzare elementi estranei nell'organismo. I test immunometrici si basano sul legame altamente specifico tra le immunoglobuline (chiamate anticorpi) e la sostanza da essi riconosciuta (la molecola estranea definita antigene). I test immunometrici consentono di rilevare specifici antigeni o anticorpi nel sangue ed in altri fluidi corporei.

Nel caso in cui i test immunometrici si prefiggano di ricercare la presenza di specifici anticorpi nel sangue o in altri fluidi corporei, gli antigeni fanno parte del sistema di rilevazione. Gli anticorpi presenti nel campione in esame, reagiscono e legano gli antigeni del sistema di rilevazione, e il test fornisce un risultato positivo. Se questo riconoscimento antigene-anticorpo non avviene, il risultato del test è negativo. Esempi di test immunometrici per la ricerca di specifici anticorpi sono il Fattore Reumatoide (FR) (che ricerca gli autoanticorpi presenti nell'artrite reumatoide), il test per il virus di West Nile (che ricerca gli anticorpi prodotti dal sistema immunitario in risposta all'infezione del virus) o il test per l'epatite B (che ricerca gli anticorpi prodotti in risposta alla vaccinazione).

Nel caso in cui i test immunometrici vengano utilizzati per la ricerca di specifici antigeni nel sangue o in altri fluidi corporei, sono invece gli anticorpi a far parte del sistema di rilevazione. La reazione tra l'anticorpo del sistema di rilevazione e l'antigene presente nel campione viene confrontata con le reazioni che avvengono a concentrazioni note di antigene, in modo da risalire alla quantità di antigene presente nel campione. Esempi di test immunometrici per la rilevazione di antigeni sono il test per la digossina o la vancomicina, i test per la misura di alcuni ormoni (come insulina, TSH, estrogeni) o i marcatori tumorali (come PSA, CA-125, AFP).

Fonti

(© 2006). Immunoassay Detection Technologies, Chapter 2. Abbott Diagnostics Scientific Resources Learning Guide [On-line information]. PDF available for download through http://www.abbottdiagnostics.com

Clarke, W. and Dufour, D. R., Editors (2006). Contemporary Practice in Clinical Chemistry, AACC Press, Washington, DC. Harris, N. and Winter, W. Chapter 10, Immunoassays. Pp. 117-119.

L'ELISA è un test immunometrico, basato sulla capacità degli anticorpi di legarsi in maniera altamente specifica agli antigeni a formare il complesso antigene-anticorpo. La presenza di un enzima consente di rilevare e misurare questo complesso.

Esistono molte combinazioni possibili, sulla base di ciò che viene ricercato (antigene o anticorpo) e sulle sua caratteristiche.

In linea generale, per rilevare o misurare un certo anticorpo nel sangue o nei fluidi di una persona, l'antigene corrispondente viene immobilizzato sopra una superficie solida. Quindi viene aggiunta una soluzione contenente il campione del paziente. Se in esso sono contenuti degli anticorpi specifici per l'antigene immobilizzato, questo si lega all'antigene. Segue l'aggiunta di un secondo anticorpo, diretto verso l'anticorpo umano e marcato con un enzima (anticorpo coniugato). Il legame tra l'anticorpo marcato e l'anticorpo in esame, viene rilevato grazie alla reazione operata dall'enzima.

Per rilevare o misurare invece uno specifico antigene nel sangue o nei fluidi di una persona, l'anticorpo specifico per quell'antigene viene immobilizzato sopra una superficie solida. Quindi viene aggiunta una soluzione contenente il campione del paziente. Se in esso sono contenuti gli antigeni ricercati, questi si legano agli anticorpi immobilizzati. Segue l'aggiunta dell'anticorpo coniugato con l'enzima, diretto verso lo stesso antigene, e la rilevazione tramite innesco della reazione operata dall'enzima (vedi immagine).

Fonti
(© 1994-2006). Introduction to Antibodies – Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Millipore Corporation [On-line information]. Available online at http://www.chemicon.com.

(2001). Gerostamoulos, J. et. al. (2001). The Use Of Elisa (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Screening In Postmortem Blood. TIAFT, The International Association of Forensic Toxicologists [On-line information]. Available online at http://www.tiaft.org.

Clarke, W. and Dufour, D. R., Editors (2006). Contemporary Practice in Clinical Chemistry, AACC Press, Washington, DC. Harris, N. and Winter, W.

Si tratta di un test in grado di rilevare proteine specifiche nel sangue e nei tessuti, tramite delle fasi che prevedono prima una separazione elettroforetica delle proteine presenti e poi il trasferimento delle stesse su delle particolari membrane. Anche in questo caso, il legame antigene-anticorpo e quindi la specificità degli anticorpi, consente di rilevare le proteine di interesse. Spesso questo esame viene utilizzato come test di secondo livello per confermare la presenza di un antigene e/o un anticorpo e quindi confermare una diagnosi. Un esempio è il test per la malattie di Lyme.

Per questo test, una goccia del campione contenete le proteine di interesse viene applicata all'estremità di uno strato di gel. Più campioni, inclusi i controlli positivi e negativi, vengono applicati in postazioni contigue (definite pozzetti). Il gel costituisce una rete attraverso la quale le proteine, sotto l'impulso di una corrente elettrica, si muovono separandosi in base alla forma e alle dimensioni, formando delle "bande". Le bande vengono quindi trasferite su una membrana, appoggiando la stessa sul gel. Le proteine di interesse vengono quindi rilevate e visualizzate grazie al riconoscimento con anticorpi coniugati (legati) a enzimi o altre molecole in grado di generare un segnale visibile. La presenza o assenza di determinate proteine viene sempre confrontata con controlli positivi e negativi noti.

Fonti

Khalsa, G. Western blotting. Arizona State University, School of Life Sciences, Mama Ji's Molecular Kitchen [On-line information]. Available online at http://lifesciences.asu.edu/resources/mamajis/western/western.html through http://lifesciences.asu.edu.

Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics. Burtis CA and Ashwood ER, Bruns DE, eds. 4th edition St. Louis: Elsevier Saunders; 2006.

Questo test molecolare utilizza delle sonde fluorescenti per valutare i geni e/o il DNA nei cromosomi.

Gli esseri umani normalmente possiedono 23 coppie di cromosomi: 22 coppie non determinanti il sesso (autosomi) e 1 coppia di cromosomi sessuali (eterocromosomi), XX per le femmine e XY per i maschi. I cromosomi sono costituiti perlopiù da DNA altamente compattato, ossia da una sequenza di quattro basi che, combinandosi i vari modi, forma i migliaia di geni responsabili della produzione di tutte le proteine del nostro organismo. Il DNA è costituito da due filamenti complementari avvolti insieme a formare una doppia elica destrorsa.

Struttura del DNA. (a) Il DNA è costituito da un doppio filamento avvolto a formare una doppia elica destrorsa. (b) I due filamenti sono antiparalleli e complementari. (c) Ciascun filamento è costituito da unità di zucchero-fosfato legate ciascuna ad una delle 4 diverse basi (adenina, guanina, citosina, timina). L'adenina è complementare alla timina e la guanina alla citosina.

Fonte immagine: OpenStax Microbiology. ​​​
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Per l'esecuzione della FISH, un campione delle cellule del paziente, contenenti il DNA, viene posto su un vetrino. Il campione può essere sangue, midollo osseo, liquido amniotico o cellule tumorali, sulla base delle necessità diagnostiche. I vetrini vengono scaldati per separare le doppie eliche del DNA (denaturazione). Quindi vene aggiunta una sonda marcata con un fluorocromo (sonda fluorescente). La sonda è un singolo filamento complementare ad una specifica regione di interesse nel DNA del paziente. Dopo la denaturazione del DNA, la sonda può legarsi alla regione di interesse, se presente. L'analisi del campione con uno speciale microscopio (microscopio a fluorescenza) consente di rilevare la sonda fluorescente come un puntino luminoso su uno sfondo scuro.

Questa tecnica consente di rilevare cromosomi sovrannumerari o mancanti, delezioni (sequenze geniche perse) o traslocazioni (sequenze geniche spostate in altri cromosomi). La FISH consente quindi di diagnosticare alcune patologie caratterizzate dalla presenza di cromosomi sovrannumerari (come la sindrome di Down o trisomia 21). Sulla base delle esigenze diagnostiche possono essere utilizzate una o più sonde differenti. Ad esempio, per analizzare più aree del DNA contemporaneamente, possono essere utilizzate sonde marcate con fluorocromi differenti e quindi facilmente distinguibili al microscopio.

I paragrafi seguenti descrivono alcuni esempi di applicazioni della tecnica FISH.

Sindrome di Down
La figura 1 mostra una FISH effettuata sulle cellule del liquido amniotico ottenute da una donna in gravidanza con un feto con sospetta sindrome di Down (trisomia 21). Il segnale verde (due copie) corrisponde al cromosoma 13, utilizzato come controllo del corretto funzionamento del test. Il segnale rosso corrisponde invece al cromosoma 21. Nell'immagine sono presenti tre segnali rossi, indicativi della presenza di tre cromosomi 21 e quindi della sindrome di Down. Per la corretta interpretazione del test è necessario rivolgersi al consulente genetico.

Figura 1: Una cellule del liquido amniotico positiva per la trisomia 21.
Fonte immagine: Courtesy of Mary Lowery Nodberg, PhD

Cancro alla mammella
Nella figura 2, la FISH viene utilizzata per rilevare la presenza di un'amplificazione genica in una cellula tumorale. Il gene HER-2/neu corrisponde al segnale rosso. In circa il 25% dei casi di tumore alla mammella, sono presenti più copie di questo gene. Le donne con un'amplificazione di HER-2/neu possono essere trattate con il farmaco Herceptina, una terapia mirata verso la proteina codificata dal gene anomalo. Le donne negative per questa alterazione non devono essere trattate con questo farmaco poiché non possono riceverne i benefici.

Figura 2: Cellule tumorali della mammella positive per l'amplificazione del gene HER-2/neu (segnale rosso). I segnali verdi corrispondono alle sonde di controllo utilizzati per verificare la corretta esecuzione del test. 

Fonte immagine: Courtesy of Mary Lowery Nodberg, PhD

Leucemia
La figura 3 mostra una FISH utilizzata per diagnosticare un tipo particolare di leucemia, la leucemia mieloide cronica. La sonda rileva la sequenza genica anomala BCR-ABL 1 originata dalla traslocazione di parte del cromosoma 22 (BCR, colore verde) e del cromosoma 9 (ABL1, colore rosso). Le aree gialle corrispondono alle zone nelle quali è presente il gene di fusione (il colore rosso e verde si sovrappongono generando il colore giallo). Il rilevamento della presenza del gene BCR-ABL 1 conferma la diagnosi di leucemia mieloide cronica; questi pazienti possono trarre beneficio dall'utilizzo del farmaco imatinib.

Figura 3: Una cellula positiva alla FISH per la traslocazione BCR-ABL 1 (segnale giallo). Il colore giallo indica la presenza del gene di fusione sul quale si legano la sonda verde, corrispondente al gene BCR, e la sonda rossa, corrispondente al gene ABL1.

Fonte immagine: Courtesy of Mary Lowery Nodberg, PhD

Fonti

(August 16, 2010) Fluorescence In Situ Hybridization (FISH). National Human Genome Research Institute [On-line information]. Available online at http://www.genome.gov/10000206 through http://www.genome.gov. Accessed March 2011.

(August 16, 2010) Frequently Asked Questions about Genetic Testing. National Human Genome Research Institute [On-line information].Available online at http://www.genome.gov/19516567 through http://www.genome.gov. Accessed March 2011.

(March 6, 2006) Genetics Home Reference. Fluorescent in situ hybridization. Available online at http://ghr.nlm.nih.gov/glossary=fluorescentinsituhybridization through http://ghr.nlm.nih.gov. Accessed March 2011.

(June 29, 2011) Hiller B, Bradtke J, Balz H and Rieder H (2004). CyDAS Online Analysis Site. Available online at http://www.cydas.org/OnlineAnalysis/ through http://www.cydas.org. Accessed July 2011. 

La PCR è una tecnica di laboratorio utilizzata molto frequentemente che consente di ottenere un numero enorme di copie di piccoli frammenti di DNA a partire da campioni contenenti quantità minime di DNA originario. Questo processo, noto come "amplificazione", consente la rilevazione e la misura dei geni d'interesse.

Il DNA è costituito dalla ripetizione di sequenze di quattro basi - adenina, timina, guanina e citosina - in grado di appaiarsi a due a due (adenina con timina e guanina con citosina). Queste sequenze formano due filamenti che si legano in maniera complementare e si avvolgono a formare una doppia elica, grazie a legami detti "a idrogeno". In ciascuna persona, le differenze nelle sequenze delle basi di ciascun filamento rendono l'assetto genetico unico. La sequenza delle basi costituisce i geni. Ciascun gene codifica per una proteina. Per farlo, la sequenza di basi del DNA viene copiata in una molecola di RNA, molecola molto simile al DNA ma a singolo filamento. Esistono circa 25.000 geni nel genoma umano e questi sono in grado di produrre moltissime proteine. Anche il DNA di microrganismi come virus e batteri è costituito da migliaia di geni codificanti per le proteine.

Come funziona la PCR?
La PCR consta di varie fasi o "cicli", effettuati grazie ad uno strumento chiamato termociclatore. Lo strumento aumenta e diminuisce la temperatura del campione ad intervalli stabiliti, nelle varie fasi:

1. La prima fase, o ciclo, di PCR consente di separare il doppio filamento di DNA in due singoli filamenti, aumentando la temperatura del campione contenente il DNA di interesse. Questa fase è chiamata "denaturazione" del DNA.
2. Una volta separati i filamenti, il campione viene raffreddato permettendo l'appaiamento di due piccole sequenze di DNA, dette primer, all'inizio e alla fine della regione di interesse. Il primer chiamato "forward" si posizione all'inizio, mentre il "reverse" si posiziona al termine della sequenza di interesse, sul filamento complementare.
3. Dopo l'appaiamento dei primer a ciascun filamento del DNA, un enzima, la Taq polimerasi, copia ciascun filamento utilizzando come innesco i primer forward e reverse. Si formano così due filamenti complementari ai filamenti originari (allungamento). La Taq polimerasi è un enzima di origine batterica (Thermus aquaticus) in grado di resistere a temperature molto elevate, come quelle presenti nei geyser o nelle sorgenti calde, la cui funzione è quella di copiare sequenze di DNA. Si tratta di un enzima particolarmente utile in laboratorio poiché è in grado di resistere alle alte temperature necessarie per l'esecuzione della PCR.
4. Il successivo innalzamento della temperatura consente la denaturazione dei filamenti neoformati e la disponibilità di quattro filamenti (due originari e due nuovi) per l'appaiamento di altri primer e, tramite il ciclo di amplificazione successivo, la formazione di ulteriori filamenti esattamente identici agli originali. Con il susseguirsi dei cicli di denaturazione, appaiamento dei primer e allungamento, si formano quindi 8, 16 ecc... filamenti.
5. Dopo 30-40 cicli, sono disponibili moltissime copie del frammento di DNA di interesse, le quali possono essere utilizzate per molteplici scopi.

DNA.

Fonte immagine: Darryl Leja, National Human Genome Research Institute

Cicli di PCR. Fonte immagine: Darryl Leja, National Human Genome Research Institute

Come viene utilizzata?
Questa tecnica può essere utilizzata, per esempio, per rilevare alcuni geni nel DNA di una persona, come quelli associati al cancro o a malattie genetiche, o per rilevare il materiale genetico virale o batterico in corso di infezioni.

Di seguito sono riportati alcuni esempi di esami di laboratorio nei quali viene utilizzata la PCR:

• JAK2
• KRAS
• Malattia di Lyme
• Pertosse
• HPV
• CMV
• Gonorrea
• Clamidia
• DNA fingerprinting

La real-time PCR (rt-PCR) è simile alla PCR classica fatta eccezione per il fatto che i prodotti di amplificazione vengono monitorati e valutati in tempo reale (real-time) piuttosto che alla fine. Il metodo real-time consente di quantificare, oltre che rilevare, il DNA presente nel campione.

RT-PCR (reverse transcriptase PCR)
Questo metodo PCR consente di amplificare l'RNA. L'RNA è un acido nucleico come il DNA ma a singolo filamento che, per poter essere amplificato tramite PCR, deve essere retrotrascritto a DNA. Per farlo, è necessario utilizzare un enzima chiamato trascrittasi inversa (reverse transcriptase, RT) e primer antisenso. Il primer lega il filamento di RNA e l'enzima RT copia l'RNA formando un singolo filamento di DNA. Questo fornisce poi lo stampo per poter sintetizzare il filamento di DNA complementare e quindi la molecola di DNA a doppio filamento. La doppia elica può quindi essere utilizzata per una PCR normale o real-time.

Di seguito sono riportati alcuni esempi d test di laboratorio che utilizzano la tecnica RT-PCR:

• HIV carica virale
• HCV

Fonti
(February 27, 2012). Polymerase Chain Reaction (PCR). National Human Genome Research Institute [On-line information]. Available online at http://www.genome.gov/10000207 through http://www.genome.gov. Accessed August 2012.

Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics. Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE, eds. St. Louis: Elsevier Saunders; Fifth edition, 2011, Pp 1412-1413.

Clarke, W. and Dufour, D. R., Editors (2006). Contemporary Practice in Clinical Chemistry, AACC Press, Washington, DC. Pp 135-137.